Усвідомлення стійкості до антибіотиків як глобальної загрози здоров’ю тварин та людей стимулює пошук альтернативних стратегій у галузі штучного осіменіння. Основна проблема полягає в ефективному пригніченні росту патогенної мікрофлори без використання антибіотиків, мінімізуючи потенційне пошкодження сперміїв.
Одним з таких рішень є гіпотермічне зберігання сперми за повної відсутності антибіотиків. Основна концепція спирається на зберігання за температури 5°С (проти традиційних 17оС), що діє бактеріостатично, з підтриманням бактеріального навантаження нижче порогового рівня (його перевищення пошкоджує спермії та негативно впливає на слизову статевих шляхів свиноматки).
Однак ключовою проблемою щодо гіпотермічого зберігання сперми є висока чутливість сперматозоїдів кнура до низьких температур. Це пов’язано з високим вмістом поліненасичених жирних кислот та низьким відношенням стеарину до фосфоліпідів у мембранах сперми. Незважаючи на обнадійливі результати in vitro та високу плодючість у першому масштабному польовому дослідженні, підтвердженому подальшим дослідженням in vitro, потрібні більш поглиблені знання про потенційне пошкодження сперматозоїдів, спричинене температурним стресом. Холодовий шок призводить до летального ураження незначної популяції сперми, але, що важливіше, його дія супроводжується великим сублетальним пошкодженням, порушуючи функціональні параметри сперми, що важко виявити звичайним аналізом.
Для оцінки сублетального пошкодження гіпотермічних сперміїв кнура було проведено відповідне дослідження. В його рамках за допомогою різнокольорової проточної цитометрії порівнювали фертильність сперми, що зберігається з антибіотиками, зі спермою, що зберігається в умовах зниженої температури (5оС). Також було зроблено мікроскопічне типування патогенів, відстежено кількість та тип бактерій при тривалому зберіганні при 5°C за відсутності антибіотиків.
Хід дослідження
Зразки сперми від дев’яти кнурів з антибіотиками зберігали в темряві при 17°C протягом 144 год. Зразки без антибіотиків повільно охолоджували і зберігали протягом такого ж часу при температурі 5°С.
Рухливість сперми оцінювали через 24, 72 і 144 год., використовуючи систему CASA AndroVision (Minitube, Німеччина) та фазово-контрастний мікроскоп (Zeiss, Німеччина).
Свіжу (нативну) сперму кнурів та відповідні зразки розбавленої сперми, що зберігали протягом 0, 24, 48 і 72 год., переносили з окремих пробірок у стерильні кріофлакони з додаванням 20% гліцерину для захисту клітин бактерій від коливань температури, а потім заморожували в рідкому азоті. Заморожені зразки зберігалися при -80°C для подальших мікробіологічних досліджень.
Загальну кількість бактеріальних клітин у розбавлених зразках сперми визначали з десятикратного розведення. Об'єм 100 мкл кожного розведення висівали на агарові пластини та інкубували протягом 48 год. при 37°С в аеробних умовах. Кількість бактерій розраховували з двох розведень у двох примірниках і виражали як колонієутворюючі одиниці на мілілітр (КУО/мл).
Для бактеріальних ізоляцій 10 мкл розширених зразків сперми з антибіотиком і без нього висівали на планшет для мікробної діагностики. Після аеробної інкубації протягом 24 год. при 37°С вихідні пластинки агару крові повторно інкубували протягом 24 год з 5% СО2. В обох випадках окремі колонії були культивовані на одній і тій же пластині та інкубовані протягом наступних 24 год. за однакових умов. Ідентифікація бактерій із чистих субкультур виконувалася за стандартними діагностичними процедурами та проводилася класичними біохімічними тестами, включаючи систему ідентифікації API від bioMérieux Deutschland (Німеччина) або аналіз генів 16S рДНК.
Різні субкультури були віднесені до трьох основних груп (грампозитивні коки, грампозитивні палички, грамнегативні бактерії) для порівняння через різноманітність видів бактерій та ізолятів, які не можна класифікувати за родом чи видовими рівнями. Серед них окремо реєстрували бактеріальні ізоляти, що потенційно викликають занепокоєння. Ця категорія включала види, які можуть негативно впливати на сперматозоїди або нести специфічні ризики у виробництві сперми, такі як потенційна бета-лактамаза розширеного спектру (ESBL) або бактерії, що продукують біоплівку, а також види, які можуть спричинити бактеріальні інфекції у свиноматок.
Результати
Рухливість сперміїв
Загальна рухливість залишалася на високому рівні протягом усього терміну зберігання, дещо вищі значення були в зразках, що зберігалися при 17°C порівняно з 5°C (рис. 1). Загальна рухливість коливалась від 89,2% ± 1,3% (24 год.) до 87,7% ± 1,3% (144 год.) для зразків, що зберігаються при 17°C, і від 86% ± 1,6% через 24 год. до 83,2% ± 1,3% через 144 год. у зразків, що зберігалися при 5°C.
Мікробіологія
Кількість бактерій у зразках сперми дев’яти кнурів представлена на рис. 2.
У зразках сирої сперми було визначено 3647 ± 2296 КУО/мл (діапазон від 318 до 21 900 КУО/мл). Під час зберігання протягом 72 год. кількість бактерій коливалась від 0 до 245 КУО/мл у зразках сперми з розбавником BTS (Minitube) з антибіотиком при 17°C, та від 0 до 773 КУО/мл у зразках, розчинених в Androstar Premium (Minitube), що зберігалися при 5°C без антибіотика. Кількість бактерій у розбавленій спермі зменшилася між 24 і 72 год. з 30 ± 27 до 5 ± 5,1 КУО/мл у зразках з BTS, що зберігалися при 17°C (з антибіотиком), і з 244 ± 84,4 до 134 ± 51,7 КУО/мл при 5°C у зразкам з Androstar Premium без антибіотика.
В усі проміжки часу кількість бактерій була вищою у зразках, що не містять антибіотик, що зберігалися при 5°С, порівняно зі зразками, що зберігалися при 17°С з антибіотиком (Р < 0,05). Сира сперма містила в середньому 5,9 ± 0,7 різних субкультур (рис. 3). Середня кількість субкультур залишалася незмінною під час зберігання протягом 72 год. з більшим числом зразків, що зберігалися при 5°C (3,0 ± 0,2), порівняно зі зразками, що зберігалися при 17°C (0,4 ± 0,1; P < 0,05). У зразках сирої сперми 50,9% субкультур було визначено як грампозитивні коки, 28,3% — грамнегативні види (переважно неферментуючі бактерії) та 20,8% — грампозитивні палички (рис. 3).
Спектр залишався подібним у зразках з Androstar Premium без антибіотика при 5°C, але демонстрував постійне зменшення грампозитивних коків наполовину до 72 год. зберігання. Навідміну від цього, зразки, що зберігалися в BTS з антибіотиком при 17°C, продемонстрували перехід у бік грамнегативних видів вже через 24 год. (83,3%) до 100% через 72 год. зберігання. Грамнегативні види були ідентифіковані як бактерії, що належать до комплексу Burkholderia cepacia, і були виділені лише з розведених зразків, але не з сирої сперми.
Три інші види бактерій, які можуть викликати занепокоєння при штучному осіменінні, а саме Pseudomonas aeruginosa, Pasteurella sp. та Escherichia coli, були виділені з сирої сперми та зі зразків з Androstar Premium без антибіотика. Подібним чином B. cepacia, P. aeruginosa (n = 6) були виділені через 72 год. зберігання при 5°C, тим часом Pasteurella (n = 3) виявлено епізодично через 24 год. зберігання та E. coli (n = 1) лише спочатку (0 год).
Отже, зберігання сперми кнурів при температурі 5°C без використання антибіотиків є потенційною альтернативою традиційному зберіганню при температурі 17°C з використанням антибіотика. Зберігання при низькій температурі ефективно пригнічує ріст бактерій у спермі кнурів та підтримує вихідний спектр бактерій з потенційною функцією у репродуктивній фізіології. Водночас варті уваги дотримання суворих гігієнічних заходів у господарстві та регулярний моніторинг стану здоров'я тварин, щоб мінімізувати бактеріальне навантаження в свіжій спермі та уникати потрапляння патогенів. Вплив холодного шоку на клітинну основу виявлені на низькому рівні і не впливали на результати фертильності.
Проведення подальших досліджень у різних умовах господарства рекомендується для оцінки ефективності запропонованого методу зберігання сперми. В цілому концепція гіпотермічного зберігання є перспективним інструментом протидії збільшенню стійкості до антибіотиків у галузі штучного осіменіння свиней.
Більш докладно про технології зберігання сперми кнурів без антибіотиків йтиметься 27 травня під час вебінару, організованого компаніями Minitube (Німеччина) і БІОТЕСТЛАБ (Україна). Спікер — Рудольф Гроссфельд, доктор наук, консультант у галузі сперматології тварин, обробки сперми та штучного осіменіння. Коспікери: Вікторія Вільямс, регіональний директор з продажів (Minitube) та Василь Смутко, консультант зі штучного осіменіння тварин (БІОТЕСТЛАБ). Участь — безкоштовна. Реєстрація — за посиланням https://biotestlab.clickmeeting.com/vebinar/register
Рис. 1. Оцінка сперміїв у зразках, збережених у розбавнику Androstar Premium при 17°C з антибіотиком (0,25 г/л гентаміцину сульфату) і при 5°C без антибіотиків.
а: по вертикалі — Загальна рухливість, %, по горизонталі — Термін зберігання, год.
б: по вертикалі — Життєздатні спермії, %, по горизонталі — Термін зберігання, год. 24 72 144
Рис. 2. Наявність бактерій у спермі
а: вертикаль — КУО/мл, по горизонталі — Розбавлена сперма.
Raw Semen – Нативна (свіжа) сперма.
б: вертикаль — Колонії,, по горизонталі — Розбавлена сперма.
17оС, BTS, з антибіотиком
5оС, Androstar Premium, без антибіотика
Рис. 3. Види субкультур бактерій у спермі
Extended semen — Розбавлена сперма
Raw semen – Нативна сперма
H — Год.
w/АВ — з антибіотиком
w/o АВ — без антибіотиків
Gram positive rods — Грампозитивні палички
Gram positive cocci — Грампозитивні коки
Gram negative species — Грамнегативні види
За матеріалами Journal of Animal Science and Biotechnology volume (2021 р.)
БіоТестЛаб:
 |
044 339-93-12 |
 |
info@biotestlab.shop |
 |
biotestlab.shop |
